Секвенирование нового поколения в диагностике инфекционных заболеваний в Израиле

Инфекционные заболевания остаются одной из ведущих причин заболеваемости и смертности во всем мире. Точная и своевременная диагностика имеет решающее значение для назначения адекватной терапии и контроля распространения инфекций. В последние годы технологии секвенирования нового поколения (next-generation sequencing, NGS) произвели революцию в области диагностики инфекционных заболеваний, предоставив беспрецедентные возможности для идентификации патогенов и изучения механизмов резистентности.

Принципы NGS

NGS, также известное как высокопроизводительное секвенирование (high-throughput sequencing), представляет собой группу методов, позволяющих параллельно секвенировать миллионы фрагментов ДНК или РНК. Основные этапы NGS включают:

1. Подготовку библиотеки - фрагментацию нуклеиновых кислот и присоединение адаптерных последовательностей.
2. Амплификацию - клональное размножение фрагментов на твердой поверхности или в эмульсии.
3. Секвенирование - определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов.
4. Биоинформатический анализ - выравнивание прочтений на референсный геном или de novo сборка, аннотация и интерпретация данных.

Наиболее распространенными платформами для NGS являются Illumina, Ion Torrent, PacBio и Oxford Nanopore.

Применение NGS в диагностике инфекций

1. Полногеномное секвенирование (WGS) изолятов - определение полной нуклеотидной последовательности бактериальных или вирусных изолятов. WGS используется для эпидемиологических расследований вспышек внутрибольничных инфекций, отслеживания путей передачи, выявления детерминант вирулентности и антибиотикорезистентности. Данные WGS в сочетании с машинным обучением позволяют предсказывать фенотипический профиль чувствительности к антибиотикам с точностью, сравнимой с традиционными методами.
2. Целевое секвенирование (tNGS) - амплификация и секвенирование специфических генов (например, 16S рРНК для бактерий) непосредственно из клинического образца. Этот метод позволяет детектировать и идентифицировать состав микроорганизмов в образце. Расширенные панели tNGS могут анализировать тысячи генов, включая детерминанты патогенности и антибиотикорезистентности, с повышенной чувствительностью.
3. Метагеномное секвенирование (mNGS) - анализ всей совокупности нуклеиновых кислот в образце, включая ДНК/РНК человека, микроорганизмов и контаминантов. mNGS - это безгипотезный метод, позволяющий выявлять любые патогены (бактерии, вирусы, грибы, паразиты). mNGS показал эффективность в детекции редких патогенов при отсутствии специфической диагностики, при атипичной клинической картине, иммунодефицитах и для раннего выявления трудно культивируемых микроорганизмов. Наиболее изучено применение mNGS для анализа СМЖ и плазмы крови.

Клиническое применение NGS при различных инфекциях

NGS может быть актуально в диагностике и лечении широкого спектра инфекционных заболеваний:

1. Сепсис: При тяжелых формах сепсиса с отрицательной гемокультурой mNGS плазмы крови может помочь идентифицировать этиологический агент и подобрать оптимальную антибиотикотерапию.
2. Менингит и энцефалит: При негативных результатах стандартных тестов mNGS спинномозговой жидкости может выявить редкие или неожиданные патогены, такие как вирусы, бактерии, грибы или паразиты.
3. Туберкулез: WGS изолятов Mycobacterium tuberculosis позволяет быстро определить профиль лекарственной устойчивости и оптимизировать схему лечения.
4. ВИЧ-инфекция: NGS применяется для выявления мутаций резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам и подбора эффективной терапии.
5. Инфекционный эндокардит: При культурально-негативном эндокардите mNGS крови или биоптата клапана может идентифицировать этиологию и помочь в выборе антибиотиков.
6. Хронические инфекции: NGS может быть полезно при хронических инфекциях с неясной этиологией, таких как хронический остеомиелит, простатит или инфекции протезированных суставов.
7. Внутрибольничные инфекции: WGS применяется для эпидемиологических расследований нозокомиальных вспышек, позволяя установить источник и пути передачи инфекции.
8. Инфекции у иммунокомпрометированных пациентов: У пациентов с иммунодефицитами NGS может выявлять оппортунистические или атипичные патогены, плохо поддающиеся стандартной диагностике.
9. Инфекции центральной нервной системы: mNGS спинномозговой жидкости может диагностировать такие заболевания, как прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия, церебральный токсоплазмоз или грибковый менингит.
10. Лихорадка неясного генеза: При длительной лихорадке неустановленной этиологии после исчерпывающего обследования mNGS образцов крови, мочи или биоптатов может помочь найти редкие или нетипичные патогены.

Ограничения прямой детекции патогенов

Как и все молекулярные методы, tNGS и mNGS зависят от присутствия микроорганизмов в клиническом образце на момент взятия. Это критично при низкой микробной нагрузке (например, Borrelia burgdorferi в плазме при болезни Лайма) или кратковременной виремии (нейротропные вирусы в СМЖ). Анализ mNGS плазмы не всегда является надежной заменой исследования локального очага инфекции.

Мощность mNGS в детекции любых нуклеиновых кислот требует тщательной интерпретации результатов. Существует риск обнаружения контаминирующей ДНК, происходящей от реагентов или предыдущих патогенов. Многие распространенные контаминанты (Enterobacterales, Staphylococcus, Pseudomonas) являются известными патогенами, что затрудняет трактовку данных. Ложноположительные находки могут приводить к ошибочным диагнозам и ненужному лечению.

Точность tNGS и mNGS зависит от качества референсных баз данных микробных геномов. Отсутствие организма или близких родственников в базе может давать ложноотрицательные результаты. Контаминация in silico, когда фрагменты человеческой ДНК попадают в геномы микробов и наоборот, способна приводить к ложным ассоциациям.

Ограничения прямой детекции генов антибиотикорезистентности (AMR)

Прямое выявление AMR генов из образцов может выполняться целенаправленно (tNGS) или случайно (mNGS). Детекция AMR с помощью mNGS зависит от типа детерминанты (полноразмерный ген или точечная мутация), обилия патогена и состава образца.

При мономикробных инфекциях с высокой нагрузкой точность выявления AMR выше за счет полноты генома. При полимикробных образцах сложно ассоциировать AMR с конкретным патогеном. Метод mNGS имеет низкую отрицательную прогностическую ценность - отсутствие гена не исключает его наличия.

Таргетные или обогащающие подходы на основе NGS могут улучшить точность детекции AMR. Методы обогащения микробных ридов и прямой сборки генома из образцов повышают чувствительность и специфичность.

Секвенирование нового поколения открывает новые горизонты в диагностике инфекционных заболеваний, обеспечивая быструю и всестороннюю идентификацию патогенов. Внедрение NGS в клиническую практику способствует улучшению диагностики, выбору оптимальной терапии и эпиднадзору за инфекциями.

Методы NGS находят применение в диагностике как острых, так и хронических инфекций, при тяжелых системных процессах, поражении ЦНС, у иммунокомпрометированных пациентов. NGS особенно ценно в ситуациях, когда стандартные методы не дают результата, или при подозрении на редкие и атипичные патогены. Своевременное применение NGS потенциально позволяет ускорить постановку диагноза, оптимизировать антимикробную терапию и улучшить исходы для пациентов.

Диагностика и лечение в Израиле — почему в клинике «Хадасса»?

• Более 100 лет организация «Хадасса» и основанные ею медицинские центры являются лидерами в области оказания медицинских услуг в Израиле.
• Более 50% исследований в области новейших медицинских технологий и методов лечения в Израиле проводятся врачами «Хадассы».